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Toxin代北京試劑
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1.2 方法
1.2.1 黃連水提液的制備
稱取干燥黃連 10 g，超微粉碎，加入 200 mL 的超純水，浸泡 2 h，大火煎
至煮沸后文火，保持 30 min，紗布過濾；藥渣加溫水 300 mL，再大火煎至煮沸
后文火煎 30 min，過濾，合并濾液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至 500 mL，10000 rpm
離心 15 min，離心取上清，定容至 100 mL，濃縮濃度為 100 mg·mL-1，用 0.22 μm
的除菌器過濾除菌，分裝 4℃冰箱保存。
1.2.2 高效液相色譜檢測黃連品質(zhì)
（1）色譜條件
色譜柱：Diamonsil C18（150 mm×4·6 mm，5 μm）；以乙腈—0.05 mol·L-1
磷酸二氫鉀溶液（50:50）（每 100 mL 中加十二垸基硫酸鈉 0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)
pH 值為 4.0）為流動相；檢測波長為 345 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。
（2）標準曲線
分別稱表小檗堿 0.0018 g，黃連堿 0.0037 g，巴馬汀 0.0024 g，鹽酸小堿
0.002 g，置于 100 mL 容量瓶中，用流動相定容，得表小檗堿濃度為 18 μg·mL-1，
黃連堿濃度為 37 μg·mL-1，巴馬汀濃度為 24 μg·mL-1，鹽酸小堿濃度為 20
μg·mL-1 的混合標準品母液。再分別稀釋得到 7 個梯度的系列對照品溶液，進高
效液相色譜儀測定，最后以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標做四種物質(zhì)的標準曲
線。
（3）供試品溶液制備
水煮法制得黃連生藥濃度為 0.1 g·mL-1 的黃連溶液，再將該溶液在 12000 rpm
轉(zhuǎn)速下離心 20 min 除去不溶性雜質(zhì)，之后取上清液 1 mL 于 10 mL 容量瓶用流動
相定容，再次用 12000 rpm 離心 15 min 除去不溶于流動相的雜質(zhì)，最后用 0.22 μm
有機系濾膜過濾既得供試品溶液。
1.2.3 細菌培養(yǎng)
（1）細菌培養(yǎng) 將菌株置于 TSB 液體培養(yǎng)液中，37℃，130 rpm 恒溫培養(yǎng)振
蕩器中培養(yǎng)，待細菌長至對數(shù)生長期時進行試驗。
（2）細菌傳代 將長至對數(shù)期的細菌，2000 rpm 離心 3 min，棄上清，用 PBS
洗一次，離心，加入適量新鮮細菌培養(yǎng)液，重懸以適當比例傳代接種到 50 mL
新鮮培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)振蕩器中繼續(xù)培養(yǎng)。
（3）細菌凍存 將對數(shù)生長期的細菌，2000 rpm 離心 3 min，棄上清，用
PBS 洗一次，離心，新鮮的培養(yǎng)液懸浮，加等體積已備好的甘油水溶液，分裝于
1.5 mL 離心管中，標明細菌株種類和凍存日期，置于-20℃冰箱中保存。
（4）細菌復(fù)蘇 從-20℃里取出凍存菌種，待其解凍，用接種環(huán)挑一環(huán)至已15
備好的固體培養(yǎng)基中，四區(qū)劃線后放于 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其長出
單菌落，用接種環(huán)挑取一個單菌落至新鮮培養(yǎng)基中進行活化。
1.2.4 MIC 的檢測
（1）菌液的準備 將凍存的痢疾桿菌接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基進行復(fù)
蘇，待其有單菌落長出，接種于已備好的新鮮、無菌胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）
培養(yǎng)基中進行活化，待其培養(yǎng)至對數(shù)期，用 TSB 液體培養(yǎng)基將痢疾桿菌濃度調(diào)
節(jié)至 105-106 cfu·mL-1。
（2）樣品準備 配適當體積的固體培養(yǎng)基高壓滅菌后加入一定體積的黃連水
提液，然后半倍稀釋，使其含藥培養(yǎng)基的濃度為 0、1.25、2.5、5、10、20 mg·mL-1，
倒入以備好的無菌平板中，每個平板中 5 mL 為宜，待其冷卻凝固之后，分別接
上以備好的菌懸液 50 μL 用涂菌器涂抹均勻，在 37℃的培養(yǎng)箱下進行培養(yǎng)。
（3）樣品檢測 細菌檢測 24 h 后，觀察平板上菌種的生長情況，以培養(yǎng)基
上無菌生長的低濃度為黃連水提液的最小抑菌濃度。
1.2.5 痢疾桿菌生長曲線
（1）藥物處理 將培養(yǎng)至對數(shù)期的痢疾桿菌接種到新鮮培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)液
中黃連水提液的終濃度為 2.5 mg·mL-1，5 mg·mL-1，10 mg·mL-1，無菌水為空白
對照組，37℃，130 rpm 搖床培養(yǎng)；
（2）準備樣品 每隔 1 h 取各組樣品 2 mL，連續(xù)取 24 h；
（3）檢測樣品 用分光光度計測定在波長為 600 的各組吸光度 OD 值，取 3
次重復(fù)實驗的平均值。繪制黃連水提液作用后痢疾桿菌的生長曲線（OD 值為縱
坐標，時間為橫坐標）。
1.2.6 培養(yǎng)液中 DNA、RNA 等大分子物質(zhì)的測定
（1）藥物處理 將培養(yǎng)至對數(shù)期的痢疾桿菌接種到新鮮培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)液
中黃連水提液的終濃度為 2.5 mg·mL-1，5mg·mL-1，10mg·mL-1，無菌水為空白對
照組，37℃，130 rpm 搖床培養(yǎng)；
（2）樣品準備 連續(xù) 12 h 取各組樣品 2 mL，離心 10 min，4000 rpm，棄沉
淀留上清。
（3）檢測樣品 用紫外分光光度計測定上清液中 DNA、RNA 等大分子物質(zhì)
的吸光度值，波長 260 nm。以無菌水為對照組，取 3 次重復(fù)實驗的平均值。
1.2.7 黃連對痢疾桿菌細胞壁的影響
將培養(yǎng)至對數(shù)期的痢疾桿菌加入到含 2.5 mg·mL-1，5 mg·mL-1，10 mg·mL-1
黃連的 TSB 液體培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基含菌體 107 cfu·mL-1，于 37℃、130 rpm 搖
床培養(yǎng)，以無菌作為對照組，分別在 0、2、4、6、8、10 和 12 h 定時取樣 5000 rpm，16
10 min 離心取上清，上清液按照表 1 加入 96 孔板中。
用酶標儀測定 96 孔板中各樣品在 520 nm 時的吸光度，并隨時間延長檢測各
時間點的吸光度變化情況，平行測定 3 次取平均值。按照公式計算 AKP 的含量
（堿性磷酸酶（金氏單位/100 mL）=[（測定孔-空白孔）/（標準空-空白孔）]×
酚標準品濃度（0.02 mg·mL-1）×100 mL）
1.2.8 黃連對痢疾桿菌呼吸代謝系統(tǒng)的影響
（1）黃連處理 將培養(yǎng)至對數(shù)期的痢疾桿菌接種到新鮮培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)液
中黃連的終濃度為 2.5 mg·mL-1，5 mg·mL-1，10 mg·mL-1，無菌水為空白對照組，
37℃，130 rpm 搖床培養(yǎng) 10 h，每組設(shè)置三個平行；
（2）準備樣品 將培養(yǎng)的菌液 5000 rpm 離心 10 min，棄去上清液，
（3）處理樣品 用 0.1 mol·L Tris-HCl（pH7.4）緩沖液洗菌沉淀 2-3 次后，
加入等體積的溶菌溶液，37℃水浴 20 min 后，立即冰浴，再加入 Tris-SDS
（pH=9.0）緩沖液 1 mL，10000 rpm 低溫離心 15 min，取出上清液；
（4）檢測樣品 酶活性的測定按試劑盒說明書操作。蛋白定量方法參照
Bradford 法
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